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AdV介導CRISPR/Cas9 敲除MSTN基因對雛雞雞腿肌肉的影響

2020-05-13

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發表期刊:International journal of molecular sciences

影響因子:4.183



文章題目:Effective MSTN Gene Knockout by AdV-Delivered CRISPR/Cas9 in Postnatal Chick Leg Muscle

技術手段:RNA-seq

派森諾生物與上海交通大學孟和教授課題組攜手合作,于2020年4月8日在《International journal of molecular sciences》上發表了通過轉錄組學方法研究MSTN敲除對雞骨骼肌的影響的研究成果。


研究背景


骨骼肌的生長發育與家禽的產量密切相關,了解雞肌肉生長發育的調控機制可以優化肉的生產效率,已經有研究確定了一些參與肌肉生長和發育調節的關鍵基因(例如MSTN,IGF1)。一些研究人員已經獲得MSTN敲除(KO)山羊,并探索了這些山羊的轉錄組特征,以研究MSTN KO對肌肉的影響。在雞中利用MSTN基因編輯研究肌肉生長發育的分子機制的研究較少。CRISPR已經在小鼠中被用于基因編輯以研究基因功能,但在雞肌肉中的應用較少,雞的一種可行方法是產后基因編輯,這也可以探索基因功能和基因治療。為了驗證是否可以在雛雞的肌肉中完成產后基因編輯并確定轉錄組的變化,作者在雛雞中敲除了MSTN并對敲除的KO肌肉和WT肌肉進行了轉錄組分析。


研究方法


CRISPR/Cas9,RNA-Seq



研究結果


1、雛雞肌肉中MSTN的敲除(KO)

實驗首先設計了針對雞的MSTN外顯子1和外顯子3的單一向導RNA (sgRNA)序列,隨后使用腺病毒(AdV)載體共表達SpCas9和這對sgRNAs(圖1A)。圖1B顯示了利用CRISPR/ cas9介導的非同源末端連接(NHEJ)在雞基因組中產生5093 bp缺失,cDNA缺失728 bp,通過實驗驗證了AdV-CRISPR體系在雞細胞中MSTN基因的編輯功能。實驗將AdV-CRISPR轉入雛雞脛前肌,分別收集3日齡(3d)和14日齡(14d)雛雞的肌肉組織(圖1C)。實驗結果證實所有轉染AdV-CRISPR的肌肉均為缺失突變體,mRNA中缺失的核苷酸數量從736個到783個不等(圖1D)。

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圖1敲除(KO) MSTN的肌肉的制備與驗證


2、KO肌肉中差異表達基因(DEGs)

本研究通過轉錄組測序檢測KO肌肉和WT肌肉的mRNA表達譜。通過比較3d KO vs 3d WT和14d KO vs 14d WT,分析MSTN KO肌肉轉錄組的差異。與WT組相比,3d和14d 的KO組MSTN表達下調,14d時差異顯著(p-value < 0.001)(圖2C)。通路分析(IPA)顯示了在3d KO vs 3d WT中有14個與MSTN相互作用的因子,在14d KO vs 14d WT中有3個互作因子(圖2D)。 FMOD、MMP9、Tnf (家族)是與MSTN互作的常見分子。IPA顯示許多差異表達基因與骨骼肌組織發育相關。有5個差異表達基因,包括MMP9、EOMES和Ex-FABP,均在兩組比較中被發現。差異基因聚類顯示了這些與骨骼肌組織發育相關的基因的表達譜(圖2E,F)。

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圖2 MSTN表達差異,差異基因火山圖和聚類熱圖


3、差異基因功能富集分析

根據獲得的DEGs,進行GO富集分析和KEGG富集分析。GO富集的結果表明,在生物過程的前6個顯著富集GO項中,兩個比較組的差異基因顯著富集在細胞分化和增殖、肌肉生長和發育、能量代謝、凋亡過程、免疫系統和信號轉導 (圖3A)。通過比對14d KO vs 14d WT的基因,實驗發現MSTN參與的GO terms,包括對胰島素受體信號通路的負調控,對凋亡過程的調控,以及對細胞因子活性的影響。

通過比較3d和14d的KO和WT骨骼肌,最相關的分子和細胞功能包括:細胞發育,細胞生長和增殖,細胞功能和維持,細胞間信號和相互作用,以及細胞運動。在3d KO vs 3d WT組和14d KO vs 14d WT兩個比較組共有的富集的15條通路中,與肌肉生長最相關通路為:PDGF信號通路和STAT3信號通路。PDGF信號通路與快速生長和更大的肌肉質量有關,而STAT3信號通路是成肌細胞增殖的關鍵介質。PA分析發現了一個14d KO vs 14d WT組中的重要基因網絡,并涉及到MSTN。該網絡與骨骼和肌肉疾病、神經系統疾病以及機體損傷和異常有關(圖3B)。

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圖 3 差異表達基因的GO富集和KEGG富集分析



研究結論


本研究在所有KO肌肉中均實現了MSTN的大片段缺失(> 5 kb),以及在第14天,MSTN基因表達明顯下調。轉錄組結果顯示差異表達基因(DEGs)與細胞分化和增殖,肌肉生長和能量代謝有關。該方法為雛雞進行產后基因編輯提供了一種潛在方法,本實驗結果也為進一步研究肌肉生長發育的機制提供了基礎。

本研究的測序和數據分析工作由上海派森諾生物科技股份有限公司完成。

原文索引:

Xu K, Han CX, Zhou H, et al. (2020) Effective MSTN Gene Knockout by AdV-Delivered CRISPR/Cas9 in Postnatal Chick Leg Muscle. International journal of molecular sciences 21(7), 2584.


文章鏈接:

https://www.mdpi.com/1422-0067/21/7/2584


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